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            細菌的簡單染色實驗
            源葉生物 / 2015-05-08

            目的
            1.學習微生物涂片和染色的基本技術,掌握細菌簡單染色法;
            2.學習無菌操作,并鞏固顯微鏡的使用方法;
            3.學習在油鏡下觀察細菌的個體形態。
            原理
                由于細菌體積小、菌體透明,活體細胞內含有大量水分,且對光線的吸收和反射與周圍背景沒有顯著的明暗差,因而很難在普通光學顯微鏡下觀察它們的形態和結構。只有經過染色,借助顏色的反襯作用才可看清菌體形態以及菌體表面結構。染色技術是觀察微生物形態結構的重要手段。
               能夠使微生物著色的化合物被稱為染色劑,染色劑一般都是成鹽化合物。目前普遍采用的微生物染色劑多為苯的衍生物,其化學結構中除含有苯環外,還連接有發色團和助色團。發色團可使化合物顯色,而助色團則能增加色度,并因具有電離特性,可與菌體細胞相結合,從而使其著色。
               含有酸性助色團(如羥基-OH)的染色劑稱為酸性染色劑,其電離后分子帶負電,可與鈉、鉀、鈣、氨等離子結合,多用于細胞質的染色,如酸性品紅、剛果紅等。含有堿性助色團(如氨基-NH2)的染色劑稱為堿性染色劑,其電離后分子帶正電,主要用于細胞核和異染粒等酸性細胞結構的染色。由于細菌細胞質中布滿核物質和異染粒等結構,因此細菌染色一般采用堿性染色劑,通常包括氯化物、硫酸鹽、醋酸鹽或草酸鹽等。
               細菌的簡單染色,即只利用一種染色劑使菌體著色。此法操作簡單,適用于細菌形態的觀察。通常細菌的簡單染色也采用堿性染色劑,如結晶紫或堿性品紅等,堿性染料不是堿而是一種鹽,電離時染料離子通常帶正電荷。而在中性、堿性或弱酸性的溶液中,細菌細胞通常帶有負電荷,這樣帶正電荷的染料離子就容易與帶負電荷的菌體細胞相結合并使其著色。染色后便于觀察細菌的形態、大小和排列方式等特征。

            材料
            1.菌種:大腸桿菌(Esecherichia coli)
            金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
            2.染料:草酸銨結晶紫染液。
            3.其它:載玻片,無菌水,洗瓶,擦鏡紙,吸水紙,二甲苯或無水乙醚:無水乙醇(3:1)混合液,香柏油及接種用具。
            方法
            一、細菌的簡單染色
            1.涂片:在潔凈的載玻片中央滴1 小滴無菌水,用無菌接種環(火焰滅菌)挑取少量大腸桿菌或金黃色葡萄球菌分別與無菌水充分混合,涂成極薄的菌膜;(注意:菌量不宜過多,否則菌體堆積成塊不易看清個體形態!)
            2.固定:手執玻片一端,將有菌膜的一面朝上,通過微火3-4 次,使水分蒸干;(注意:可用手背接觸涂片反面,以不燙手為宜。否則過分烘烤會導致菌體變形!)
            3.染色:將玻片置于玻片架上,待其冷卻后,在涂片部位滴加適量(蓋滿菌膜)的草酸銨結晶紫染液,染色1 分鐘;
            4.水洗:傾去染液,用普通蒸餾水自玻片一端輕輕沖洗,至流下的水中無染液的顏色為止。
            5.干燥:用吸水紙吸去多余水分;(注意:勿擦去菌體!)
            6.鏡檢:在低倍鏡下找到視野后,轉換油鏡觀察,繪制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌形態圖;
            7.清理:實驗完畢后,清潔油鏡頭,整理顯微鏡使其復原并在記錄本上登記。將染色片放入含有5%苯酚的廢片缸中。
            二、油鏡的使用和清理
            1.油鏡的使用:
            (1)在低倍鏡下找到鏡檢部位后,用粗螺旋將鏡筒提升約2 厘米,將油鏡轉置鏡筒正下方;
            (2)在鏡檢部位滴上1 滴香柏油;
            (3)從側面注視,用粗螺旋將鏡筒小心降下,使油鏡侵入香柏油中,讓鏡頭幾乎與標本相接;(注意:不要用力過猛以免壓碎玻片損壞鏡頭!)
            (4)從目鏡觀察,調節光線使其明亮,再調節細螺旋使鏡筒緩慢提升,直至視野內出現清晰物象為止。
            2.油鏡的清理:
               觀察完畢,提升鏡筒。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油,接著用另一張擦鏡紙蘸少許二甲苯擦去鏡頭上殘留的油跡,最后用干凈擦鏡紙再擦拭兩遍以除去殘留的二甲苯。涂片處香柏油的處理與此相同。(注意:不要過量使用二甲苯,以免其殘留在鏡頭上影響觀察!)
            結果
            分別繪出油鏡下大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形態圖,注明放大倍數,并描述它們的排列方式。

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